Biozellen®基質膠 特點：

1、植物源材料，無任何動物成分；

2、胺基酸序列人源化 ；

3、可調控基質膠硬度進行多種細胞培養；

4、3D細胞/類器官培養種類數量范圍更廣；

5、無人畜共通病原菌或毒素風險；

6、用于醫療級生物原料；

7、高活性、高純度、可融化；

8、2年保存時間；

9、3D培養結束后基質膠可以溫和融化，并保留3D細胞/類器官結構完整性；

Biozellen®3D類器官培養基質膠套裝

Catalog No. B-P-00003-2、B-P-00003-4、B-P-00003-10

Specification 2ml-kit、4ml-kit 、10ml-kit

Storage Store at-20℃. 1年保存.

一、產品描述

Biozellen®3D類器官培養基質膠套裝包含整套基質膠、膠體固定液、膠體溶解液，可應用到3D細胞培養與微環境應用等；本試劑盒操作便利且可調控基質膠硬度進行多種細胞培養測試；植物膠體可快速形成水凝膠， 請操作前詳細閱讀此使用指南。

（Biozellen®3D類器官培養基質膠材料為植物來源，無動物成分）

二、應用

•3D類器官培養。

•3D細胞球體培養試驗

•細胞侵襲

•細胞遷移

•小鼠皮下成瘤

•適合用于3D細胞藥物篩檢平臺

•細胞生長和分化

•代謝/毒理學研究

•體外和體內血管生成分析

三、適用細胞種類

• 原代細胞 • 干細胞

四、試劑盒組分

五、使用步驟：

A、試劑制備

A基質膠：將A基質膠溶于37℃水浴槽回溫10分鐘， 確認*融解.

C緩沖溶液(1X)制備：使用前將10X C緩沖溶液用冰的無細胞培養液(例如： 無血清DMEM、opt-MEM) 制備成 1X C 緩沖溶液。(不要用 PBS 稀釋 C 緩沖液) .

D 緩沖溶液(1X)制備: 使用前用冷的 1x PBS 稀釋 10X D 緩沖溶液至 1X D 緩沖溶液.

B、Biozellen®3D類器官培養基質膠的制備

全部步驟需要在無菌環境內操作，操作步驟如下：

1. 將24孔培養板放置于冰箱或者冰上預冷。

2. 細胞計數后取 2×105~2×107 細胞與 0.5ml 37℃ 培養基均勻混合，并與0.5ml 37℃ A膠按照 1:1 等比例均勻混合，最終細胞密度1*105~1*107cells/mL。

注：請選擇適當的培養溶液與條件進行試驗。

3.取 20-40 微升步驟 2 含細胞的混合 A 膠溶液滴于 步驟 1 預冷的培養板上，膠體將于 5 分鐘內成膠。 注: 測試膠體是否成膠，可用微量吸管尖溫和的觸碰膠體表面進行確認。

4.待膠體成膠后，添加1毫升冰的1X C緩沖溶液，并蓋過步驟3 的膠溶液，固定 15 分鐘。

5.待15分鐘固定后，小心的吸取 C 緩沖溶液并置換為適合此細胞生長之培養基溶液。

6將含有細胞的膠于37°C 二氧化碳培養箱內進行7~14天的培養，并觀察細胞球體的形成，按正常培養基更換頻率進行更換操作。

C、溶膠與收集細胞球體準備程序

小心的將培養基吸取移除，并用1X PBS進行清洗。

小心的將 1X PBS 吸取移除，并添加 1 毫升冰的D緩沖溶液，蓋過膠滴于室溫反應 5分鐘。

溫和的用1毫升移液管吸取，直到膠滴*溶解。

將含有細胞球體的溶液吸入1.5 毫升離心管，用1000 rpm的轉速離心10分鐘，移除上清液體并收集細胞球體做分析。

D、收集單顆細胞準備程序

在分離單細胞前，先按上述溶膠與收集細胞球體準備程序進行操作

1. 添加trypsin-EDTA并與收集的細胞球體于37°C混合反應。

2. 用1毫升移液管混合，直到細胞體*分解。

3. 待細胞球體*分解，加入3倍體積的1X PBS，并用1000轉的轉速進行離心10分鐘，并移除上清液體收集沉淀的單細胞做分析。

六、細胞侵襲實驗準備程序

A、試劑準備:

1、C緩沖溶液 (0.5 X) 制備 : 使用37 ℃水浴回溫的無血清細胞培養液 (例如: 無血清DMEM（不可以用PBS稀釋）等，用于稀釋A膠) 稀釋C緩沖溶液 (10 X) (貨號: B-P-00003-C)至C緩沖溶液 (0.5 X), 即體積稀釋20倍。使用前放置37度水浴槽。 (例如:1 mL C緩沖溶液 (10 X) + 19 ml 無血清DMEM; 如未使用完畢，可保存于4 ℃ 冰箱, 保存一周)

2、A膠 (1X) 制備 : 將 A膠 (2X) (貨號: B-P-00003-A) 置于37 ℃水浴槽回溫10分鐘，確認*溶解。再將37 ℃水浴回溫的無血清細胞培養液取 0.5 mL，加至37 ℃已溶解的 0.5 mL A膠 (2X)，配置成1 mL 的 A膠 (1X)。使用前置于37度，可降低A膠黏度。(單次使用，勿重復冷凍解凍 A膠 (1X) )

B、細胞侵襲實驗步驟

1、準備適用24孔板的Transwell裝置(例如:康寧Transwell insert, 8 μm PET membrane)。

2、用37 ℃已回溫的C緩沖溶液 (0.5 X)將A膠 (1X) 原液體積稀釋5-20倍，建議一開始可選用15倍。 (根據細胞種類做稀釋比例對比實驗，找出自己實驗體系的稀釋倍數，稀釋倍數越高，膠體越軟，越容易穿透)

3、根據Transwell上室底部面積加入步驟2的 0.1 mL 稀釋后的A膠稀釋液到Transwell上室中。

4、將步驟4在 4 ℃ 冰箱孵育2-3小時。

5、在Transwell上室中加入0.1 mL 無血清的細胞懸液，使細胞最終濃度約7.5 x 104 cells/well.。

6、在Transwell下室中加入0.8 mL 含10 %血清的細胞培養液做為chemoattractant，吸引細胞進行遷移及分泌基質蛋白酶 (MMP) 侵襲。 (對照組為Transwell下室中加入含0.8ml無血清的細胞培養液)。

7、將細胞培養板在37 ℃, 5 % CO2培養箱孵育24-48 小時。

8、移除培養液，以PBS 清洗2次。

9、用棉簽輕輕擦掉上層未遷移的細胞。

10、加入1 ml 100 % 甲醇室溫固定30分鐘,再以PBS 清洗2次。

11、加入 1 ml 0.1 % 結晶紫染液 ( 0.1 % (g/ml) PBS 結晶紫) 室溫染色20 分鐘，再以PBS 清洗2次。

12、將Transwell移至載玻片上，在顯微鏡下隨機6-9個視野觀察計算遷移的細胞數。

七、小鼠皮下成瘤實驗準備程序

A、細胞房內材料準備、試劑制備及步驟

(1) 材料準備:

1. 冰盒、2. 37 ℃ 水浴槽、3. C緩沖溶液(10X)、4. 無血清細胞培養液 (例如: 無血清DMEM，DMEM-F12等，不可用 PBS )、5. A膠 (2X)、6. 細胞培養液、7. 23-26G針頭、8. 1 mL針筒、9. 細胞。

(2) 試劑制備:

1、C緩沖溶液 (0.5 X) 制備 : 使用 37 ℃ 水浴回溫的無血清細胞培養液 (例如: 無血清DMEM或DMEM-F12等，不可用 PBS ) 稀釋 C緩沖溶液 (10 X) 至 C緩沖溶液 (0.5 X), 即體積稀釋20倍。使用前放置37度水浴槽。(例如:1 mL C緩沖溶液 (10 X) + 19 ml 無血清DMEM; 若未使用完畢，可先保存于4 ℃ 冰箱, 保存一周)

2、A膠 (1X) 制備 : 將 A膠 (2X) (貨號:B-P-00003-A) 置于37 ℃ 水浴槽回溫10分鐘，確認*溶解。再將 37 ℃ 水浴回溫的無血清細胞培養液取 0.5 mL， 加至 37 ℃ 已溶解的 0.5 mL A膠 (2X)，配置成 1 mL 的 A膠 (1X)。使用前置于37度，可降低黏度。 (單次使用，勿重復冷凍解凍 A膠 (1X) )

(3)步驟:

1、取細胞溶液離心后收集細胞沉淀，與C緩沖溶液 (0.5 X) 均勻混合使細胞濃度為3*106 cells/mL。

2、A膠 (1X) 與步驟 1 含 C緩沖溶液 (0.5 X) 的細胞系懸浮液，按照 2:1 比例均勻混合配置，細胞懸浮液最終濃度為 106 cells/mL。使用前置于37℃，可降低黏度。 (C緩沖溶液用于A膠凝膠反應，例如0.5ml C 緩沖溶液(0.5 X)含細胞 加入 1ml A膠 (1X) 混合成1.5ml 的注射液)

3、選用 23-26 G 的針頭 (建議選用 24 G) 及 1 mL 針筒，抽取 步驟2 A膠與 C緩沖溶液的細胞混合液至所需注射體積 (例如:0.2-0.6 mL) 。室溫37℃至20℃操作抽取。 (若抽取時發生塞針狀態，可先把針頭拔掉，以針筒進行抽取，建議一次抽取配置好所需針筒數量，避免步驟2 溶液過度凝膠，發生塞針)

4、將抽取好步驟 3 的針筒，帶入動物房, 若短時間無法施打建議置于冰上。

B、動物房內材料準備及步驟

(1)材料準備:

1. 含 A膠與 C緩沖溶液的細胞混合液的針筒、2. 皮膚消毒劑 (例如 : 酒精)、

3. 手套、4. 實驗小鼠、5. 麻醉小鼠的試劑

(2)步驟:

1、室溫下可直接注射。若是置于冰盒上的針筒，回到室溫后，待液化再進行注射。 含 A膠與 C緩沖溶液的細胞混合液的針筒，以皮下注射方式，注射實驗所需的體積至實驗鼠 (建議皮下注射量為 0.2 mL，實際狀況依需求而定)。(針筒放冰上注射阻力會上升, 放室溫會液化注射阻力小。注射時若因凝膠緣故而阻力變大，需緩慢注射避免針頭噴落)

注1 : 注射體積可依不同實驗目的做調整，若為皮下血管生成研究注射體積需至少0.5 mL以上。

注2 : 此步驟依實驗需求可執行或不執行，若需呈現明顯的皮下注射隆起效果，可調整2.試劑制備將C緩沖溶液 (10 X) 稀釋15倍，變成C緩沖溶液 (0.66 X)，再執行后續成膠實驗；提高C濃度，可提高膠體硬度。

2、培養一至三周后觀察量測接種的腫瘤尺寸。

注3 : 若為血管生成研究，應注射含VEGF及heparin的A膠，以促進血管生成。約三天后，可摘取含有新血管生成的腫瘤組織。