轉染已經成為研究和控制真核細胞基因功能的常規工具
更新時間：2021-07-07 點擊次數：890次
轉染技術是指將外源分子如DNA，RNA等導入真核細胞的技術。隨著分子生物學和細胞生物學研究的不斷發展，轉染已經成為研究和控制真核細胞基因功能的常規工具。在研究基因功能、調控基因表達、突變分析和蛋白質生產等生物學試驗中，其應用越來越廣泛。影響轉染效率的因素有很多，細胞株本身的特性和活性，細胞培養條件，轉染的DNA或RNA的質量，轉染方法，轉染試劑的選擇等。
常規轉染技術可分為兩大類，一類是瞬時轉染，一類是穩定轉染（永久轉染）。前者外源DNA/RNA不整合到宿主染色體中，因此一個宿主細胞中可存在多個拷貝數，產生高水平的表達，但通常只持續幾天，多用于啟動子和其它調控元件的分析。一般來說，超螺旋質粒DNA轉染效率較高，在轉染后24-72小時內（依賴于各種不同的構建）分析結果，常常用到一些報告系統如熒光蛋白，β - 半乳糖苷酶等來幫助檢測。后者也稱穩定轉染，外源DNA既可以整合到宿主染色體中，也可能作為一種游離體（episome）存在。盡管線性DNA比超螺旋DNA轉入量低但整合率高。外源DNA整合到染色體中概率很小，大約1/104轉染細胞能整合，通常需要通過一些選擇性標記，如來氨丙基轉移酶（APH；新霉素抗性基因），潮霉素B磷酸轉移酶（HPH），胸苷激酶（TK）等反復篩選，得到穩定轉染的同源細胞系。
轉染效率受多種因素影響，主要因素有下面幾個：
1．轉染試劑
不同細胞系轉染效率通常不同，但細胞系的選擇通常是根據實驗的需要，因此在轉染實驗前應根據實驗要求和細胞特性選擇適合的轉染試劑。每種轉染試劑都會提供一些已經成功轉染的細胞株列表和文獻，通過這些資料可選擇適合實驗設計的轉染試劑。當然，更適合的是高效、低毒、方便、廉價的轉染試劑。
2．細胞狀態
一般低的細胞代數（<50）能確保基因型不變。適合轉染的細胞是經過幾次傳代后達到指數生長期的細胞，細胞生長旺盛，最容易轉染。細胞培養在實驗室中保存數月和數年后會經歷突變，總染色體重組或基因調控變化等而演化。這會導致和轉染相關的細胞行為的變化。也就是說同一種系的細胞株，在各實驗室不同培養條件下，其生物學性狀發生不同程度的改變，導致其轉染特性也發生變化。因此，如果發現轉染效率降低，可以試著轉染新鮮培養的細胞以恢復最佳結果。
3．轉染方法
不同轉染試劑有不同的轉染方法，但大多大同小異。轉染時應跟據具體轉染試劑推薦的方法，但也要注意，因不同實驗室培養的細胞性質不同，質粒定量差異，操作手法上的差異等，其轉染效果可能不同，應根據實驗室的具體條件來確定最佳轉染條件。
（1）細胞培養物
健康的細胞培養物是成功轉染的基礎。不同細胞有不同的培養基，血清和添加物。高的轉染效率需要一定的細胞密度，一般的轉染試劑都會有專門的說明。推薦在轉染前24小時分細胞，這將提供正常細胞代謝，增加對外源DNA攝入的可能。一定要避免細菌，支原體或真菌的污染。
（2）細胞密度
細胞密度對轉染效率有一定的影響。不同的轉染試劑，要求轉染時的最適細胞密度各不相同，即使同一種試劑，也會因不同的細胞類型或應用而異。轉染時過高或者過低的細胞密度會導致轉染效率降低，乃至表達水平偏低。因此如果選用新的細胞系或者新的轉染試劑，最好能夠進行優化實驗并為以后的實驗建立一個穩定方法，包括適當的接種量和培養時間等等。陽離子脂質體具有微量的細胞毒性而往往需要更高的鋪板密度或者更多的懸浮細胞數，有的要求細胞90%匯片；而有些多胺或者非脂質體的配方則要求在40%-80%之間，總之是盡量在細胞最適的生理狀態下轉染，以求最佳的轉染效果。不同的實驗目的也會影響轉染時的鋪板密度，比如研究細胞周期相關基因等表達周期長的基因，就需要較低的鋪板密度，所以需要選擇能夠在較低鋪板密度下進行轉染的試劑。一般轉染時貼壁細胞密度為50%-90%，但這個需要參考所選轉染試劑的說明書。
（3）血清
血清一度曾被認為會降低轉染效率，老一代的轉染方法往往要求轉染前后洗細胞或者在無血清培養基條件下轉染，但有些對此敏感的細胞如原代細胞會受到損傷，甚至死亡導致轉染效率極低。不過轉染產品配方幾經革新后的今天，對于主流的轉染試劑來說，血清的存在已經不會影響轉染效率，甚至還有助于提高轉染效率，如陽離子聚合物等，血清的存在會影響DNA—轉染復合物的形成，但只要在DNA-轉染復合物形成時用無血清培養基或PBS來稀釋DNA和轉染試劑就可以了，在轉染過程中是可以使用血清的。不過要特別注意：對于RNA轉染，如何消除血清中潛在的RNase污染是值得關注的。胎牛血清（FCS）經常用到，便宜一點的有馬或牛血清。通常的，血清是一種包含生長因子及其它輔助因子的不確切成分的添加物，對不同細胞的生長作用有很大的差別。血清質量的變化直接影響細胞生長，因此也會影響轉染效率。新加培養基的預熱對細胞轉染很有幫助。
（4）抗生素
細胞培養過程中往往會添加抗生素來防止污染，但是這些添加劑可能對轉染造成麻煩。比如青霉素和鏈霉素，就是影響轉染的培養基添加物。這些抗生素一般對于真核細胞無毒，但有些轉染試劑增加了細胞的通透性，使抗生素可以進入細胞。這可能間接導致細胞死亡，造成轉染效率低。目前轉染試劑因為全程都可以用有血清和抗生素等添加劑的*培養基來操作，非常方便，省去了污染等麻煩。
（5）氮磷（N/P）比
N/P比是轉染效率的關鍵（為了換算方便，一般以DNA/轉染試劑質量比表示），在一定比例范圍內轉染效率隨N/P比成比例增高，之后達到平值，但毒性也隨之而增加，因此在實驗之前應根據推薦比例，確定本實驗的最佳轉染比例。
（6）DNA質量
DNA質量對轉染效率影響非常大。一般的轉染技術（如脂質體等）基于電荷吸引原理，如果DNA不純，如帶少量的鹽離子，蛋白，代謝物污染都會顯著影響轉染復合物的有效形成及轉染的進行，但對GenEscort系列轉染試劑影響不大。此外，對一些內毒素敏感的細胞（如原代細胞，懸浮細胞和造血細胞），QIAGEN還提供可去除內毒素污染的質粒抽提試劑盒，在質粒抽提過程中有效去除脂多糖分子，保證理想的轉染效果。但如果使用GenEscort轉染試劑，一般不需要這么高的DNA質量要求。當使用GenEscort轉染試劑時，即使采用傳統的酚－氯仿沉淀方法純化質粒，仍然可達到非常好的轉染效果，但所用的質粒量比試劑盒純化方法的DNA用量大一些。
4．載體構建
轉染載體的構建（病毒載體，質粒DNA，RNA，PCR產物，寡核苷酸等）也影響轉染結果。病毒載體對特定宿主細胞感染效率較高，但不同病毒載體有其特定的宿主，有的還要求特定的細胞周期，如逆轉錄病毒需侵染分裂期的宿主細胞，此外還需考慮一些安全問題（如基因污染）。除載體構建外，載體的形態及大小對轉染效率也有不同的影響，如前面提到的超螺旋及線性DNA對瞬時和穩定轉染的影響。如果基因產物對細胞有毒性作用，轉染也很難進行，因此選擇組成或可調控，強度合適的啟動子也很重要，同時做空載體及其它基因的相同載體構建的轉染正對照可排除毒性影響的干擾。
